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From: Domingo Galán Alberto <alberto.domingo@uah.es>
Sent: miércoles, 29 de junio de 2022 10:48
To:
Cc: Domingo Galán Alberto <alberto.domingo@uah.es>
Subject: ensayo post mail
Alberto Domingo Galán
Profesor Titular de Universidad
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE SISTEMAS
Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud.
Campus universitario.
28871 Alcalá de Henares (Madrid)
Teléfonos: 91 885 4520 / 645014264
alberto.domingo
Alberto Domingo Galán
Profesor Titular de Universidad
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE SISTEMAS
Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud.
Campus universitario.
28871 Alcalá de Henares (Madrid)
Teléfonos: 91 885 4520 / 645014264
alberto.domingo
Autor: Vicente Baz, Jorge
Departamento: Biología de Sistemas
Director: Rivera Arconada, Iván
Fecha de la lectura: 25/06/2021
Calificación: Sobresaliente Cum Laude
Programa: Señalización Celular (RD 99/2011)
Tiene mención internacional: No
Resumen: El dolor crónico constituye uno de los principales problemas sanitarios en los países desarrollados, siendo una de las causas más frecuentes de sufrimiento e incapacidad. La utilización de fármacos analgésicos es una vía importante en el tratamiento del dolor. Sin embargo, diversas patologías que cursan con dolor todavía carecen de tratamientos eficaces. El estudio de los canales iónicos como diana farmacológica en analgesia constituye un área de investigación que ha crecido mucho en los últimos años. Los canales de potasio de la familia Kv7 son importantes reguladores de la excitabilidad neuronal. Se expresan en diferentes elementos de las vías nociceptivas, incluidas las neuronas aferentes primarias y la médula espinal, y su activación es capaz de producir analgesia. El desarrollo de los canales Kv7 como diana terapéutica requiere de una mejor caracterización de su papel en las vías nociceptivas, así como de fármacos específicos y selectivos para evitar efectos no deseados. Los objetivos de esta Tesis Doctoral han sido estudiar las acciones de ICA-069673 y ML213, dos nuevos facilitadores de los canales Kv7, sobre el procesamiento de la información nociceptiva en la médula espinal. Además, se ha querido estudiar el papel antinociceptivo de los antiinflamatorios celecoxib y diclofenaco a nivel espinal, y comprobar la implicación de los canales Kv7 en sus efectos. Para llevar a cabo estos objetivos se realizaron estudios electrofisiológicos y farmacológicos en preparaciones de médula espinal de ratón mantenidas en condiciones in vitro. Se registraron los reflejos espinales nociceptivos y no nociceptivos y las respuestas de neuronas del asta dorsal a la estimulación eléctrica de las aferentes primarias nociceptivas. En las condiciones utilizadas, los compuestos estudiados deprimieron la transmisión nociceptiva espinal con un perfil de acción similar a otros fármacos analgésicos, afectando preferentemente al wind-up de los reflejos espinales. Además, ML213 y celecoxib inhibieron las respuestas de neuronas del asta dorsal a la estimulación de aferentes nociceptivas, indicando una acción directa sobre las neuronas sensoriales. Sin embargo, diclofenaco mostró sobre todo efectos en el componente motor de la médula espinal. El bloqueo previo de los canales Kv7 con XE-991 fue capaz de prevenir estos efectos depresores, lo que sugiere que la activación de los canales Kv7 es el principal mecanismo de acción de estos fármacos. En conjunto, estos resultados refuerzan la importancia de los canales Kv7 en la modulación de la excitabilidad de las vías nociceptivas y su validez como diana terapéutica para el tratamiento del dolor. Los efectos observados con estos moduladores de canales Kv7 indican que podrían existir conformaciones distintas de estos canales entre los circuitos espinales sensoriales y motores. Estas diferencias podrían permitir diseñar fármacos analgésicos selectivos sobre los canales Kv7 presentes en áreas sensoriales de la médula espinal y que no afecten a las funciones motoras.
Autor: Lopez Llorente, Veronica
Departamento: Biología de Sistemas
Director: Jorcano Noval, José Luis
Codirector/es: García Díez, Marta; Rodríguez Rodríguez, Francisco Javier
Fecha de la lectura: 05/07/2021
Calificación: Sobresaliente Cum Laude
Programa: Señalización Celular (RD 99/2011)
Tiene mención internacional: No
Resumen: Mechanobiology studies the interplay between the cell and its environment to correlate cellular functions with physical forces. Cells have the ability to exert active forces on their surroundings and, in turn, are able to sense and respond to changes in mechanical properties of the extracellular matrix. This bi-directional communication controls many relevant biological processes, such as morphogenesis, tissue repair or cell migration, proliferation, and differentiation. Dysregulation of these highly coordinated mechanisms, results in the appearance of pathological processes such as cancer invasion, chronic wounds, or skin fragility disorders. The inherent difficulty in measuring certain physical quantities such as force, in a biological system, has meant that most advances in this field are due primarily to a deeper knowledge of the biochemical processes that govern these mechanisms. A full understanding of mechanobiology, however, requires a combined study of biological and physical phenomena. In this regard, a variety of techniques have been developed that have provided us with qualitative and quantitative data on the kinematics and dynamics of cell behavior. These methods in turn, are often complemented by theoretical models that decipher and predict biological behavior based on the laws of physics. Nevertheless, in the context of an organism, most tissues acquire a three-dimensional structure, so there is a need for these measurement techniques to be applicable to 3D environments. Much remains to be developed and improved in this direction, as 3D measurement techniques still present many difficulties. The present thesis reports the development of a new 2D force measurement technique based on a flexible structure of known mechanical properties. This cantilever-based force sensor is deformed by epidermal keratinocytes as they migrate, in a wound healing experimental setup. The resultant deflection of the structure is detected over time by image analysis to infer the forces exerted by the cells. According to the results obtained, an active fluid based theoretical model was formulated that represents the fundamental characteristics of the system and predicts the evolution of its behavior. Thereby, we established a reproducible, easy to implement and affordable 2D force measurement tool. On the other hand, the proposed theoretical model, collects the essential ingredients needed to describe how a multicellular tissue modulates the force it exerts depending on the compliance of its external surroundings. One of its most advantageous features is that its reduced complexity allows for easier interpretation and possible incorporation into other more complex models. This measurement technique was subsequently tested in a Kindler syndrome cellular model, which was generated using the CRISPR/Cas9 tool to produce the loss of kindlin-1 expression. The results obtained showed that, in our specific context, the force measurement tool is sensitive enough to detect a difference between the forces and mechanical work exerted by healthy cells and those exerted by cells exhibiting poor adhesion to the substrate. Furthermore, we also studied the distribution of the cytoskeleton and cell adhesions of the migrating monolayer when interacting with the force sensor, to characterize how cells respond to this experimental environment. Future perspectives focus on a deeper molecular and metabolic characterization of the cellular responses upon interaction with a compliant body and the adaptation of the force sensor to a 3D environment.
Autor: Frezza , Valerio
Departamento: Biología de Sistemas
Director: González Muñoz, Víctor Manuel
Codirector/es: García Sacristán, Ana
Fecha de la lectura: 16/07/2021
Calificación: Sobresaliente Cum Laude
Programa: Señalización Celular (RD 99/2011)
Tiene mención internacional: No
Resumen: Métodos: Partiendo de una población de aptámeros de ssDNA obtenida previamente contra la proteína histona H3 de Leishmania infantum (LiH3), identificamos dos aptámeros individuales, AptLiH3#4 y AptLiH3#10. A continuación, realizamos ensayos ELONA, western blot y slot blot para establecer la especificidad y afinidad de los aptámeros por la histona LiH3. También, realizamos ensayos ELONA utilizando péptidos correspondientes a secuencias superpuestas de LiH3 para mapear la interacción aptámero:LiH3. Además, desarrollamos diferentes sistemas de detección basados en ELONA utilizando los aptámeros como moléculas de reconocimiento y detección para determinar cuál es el que muestra una mayor sensibilidad. Resultados: Ambos aptámeros tienen alta afinidad y especificidad por LiH3 endógena en lisados de promastigotes. De los diferentes sistemas ensayados, hemos confirmado que el ELONA acoplado a PCR a tiempo real (ELONA-qPCR) es el más sensible, alcanzándose un límite de detección de 600 parásitos. Conclusiones: Los aptámeros identificados podrían ser utilizados como moléculas de bioreconocimiento de la histona LiH3, pero es necesario optimizar el sistema de detección para su uso en el diagnóstico de la leishmaniasis.
Autor: Gallego Tamayo, Beatriz
Departamento: Biología de Sistemas
Director: Chiloeches Gálvez, Antonio
Fecha de la lectura: 13/12/2021
Calificación: Sobresaliente Cum Laude
Programa: Señalización Celular (RD 99/2011)
Tiene mención internacional: No
Resumen: El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo y la selección de dianas terapéuticas para su tratamiento ha avanzado mucho en los últimos años. Una de las principales rutas de señalización alteradas en cáncer y directamente relacionada con muchas de las capacidades distintivas de los tumores es la ruta RAS-RAF-MEK-ERK. Dentro de esta vía, la mutación V600EBRAF es de las más frecuentemente implicadas en procesos tumorales. La expresión de este mutante es especialmente habitual en melanoma y tumores tiroideos, donde su presencia aumenta la capacidad proliferativa, invasiva y metastásica de estas células. Por todo ello, se han desarrollado numerosos inhibidores selectivos de este mutante que, aunque han demostrado cierta efectividad en melanoma, no han mejorado la eficacia de las terapias antitumorales tanto como se esperaba. Esto se debe a la frecuente aparición de resistencias ante este tipo de tratamientos. Por otro lado, una de las capacidades asociadas a la carcinogénesis que ha adquirido mayor relevancia en los últimos años es la reprogramación metabólica de las células tumorales. Esta característica favorece el crecimiento, supervivencia, proliferación, invasión y metástasis tumoral, así como la aparición de resistencias a tratamientos convencionales. Por todo ello, se han desarrollado terapias antitumorales basadas en inhibidores del metabolismo tanto de la glucosa como de la glutamina, nutrientes esenciales para el desarrollo tumoral. Debido a todo esto, nosotros estudiamos la relación del mutante V600EBRAF con la reprogramación metabólica de la glucosa y la glutamina en células tumorales tiroideas y los mecanismos moleculares implicados. Para ello, utilizamos tres líneas celulares de cáncer de tiroides derivadas de tumores pobremente diferenciados o anaplásicos, que poseen la mutación V600EBRAF, en las que modulamos su actividad con distintas estrategias. Además, analizamos la importancia del metabolismo de la glucosa, glutamina y otros aminoácidos en la supervivencia tumoral, así como el efecto de su bloqueo sobre la eficacia terapéutica de la inhibición de V600EBRAF tanto in vitro, como en un modelo in vivo. Nuestros resultados muestran que las células tumorales tiroideas con la mutación V600EBRAF dependen de la disponibilidad y metabolismo de la glucosa y la glutamina para su supervivencia, y que la inhibición de estos procesos catabólicos conlleva un aumento de la muerte celular. Además, demostramos que V600EBRAF se encuentra implicado en el mantenimiento de la respiración celular y producción de ATP, así como en la dependencia de la oxidación de la glucosa y glutamina para mantenerla. Además, V600EBRAF incrementa el flujo glucolítico a través del aumento en la expresión de GLUT-1 y HK-II de forma dependiente del factor de transcripción HIF-1¿ y, probablemente, MYC. En cuanto al metabolismo de la glutamina, demostramos que la inhibición de V600EBRAF no modifica los niveles de este aminoácido, pero sí la síntesis de asparagina de forma dependiente de ASNS, a través de la vía de estrés del retículo. Por otra parte, la inhibición conjunta de V600EBRAF y el metabolismo de la glucosa o la asparagina sinergizan en la disminución de la supervivencia celular, aunque los mecanismos varían según la línea celular. Asimismo, demostramos que la inhibición de la glucolisis tiene un efecto antitumoral y aumenta la sensibilidad a la inhibición de V600EBRAF in vivo. En conjunto, estos datos señalan la inhibición metabólica de la glucolisis y la asparagina como una buena estrategia terapéutica para mejorar la eficacia de tratamientos con inhibidores de V600EBRAF en tumores tiroideos que no responden con la eficacia esperada o generen resistencias a este tratamiento.
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